更锋利、更小巧：微小的 CRISPR 工具可帮助清除病毒

莱斯大学的科学家们详细描述了用于切碎或修改 RNA 的已知最小 CRISPR-Cas13 系统之一的三维结构，并利用他们的发现进一步改造了这一工具，以提高其精确度。根据发表在《自然-通讯》（Nature Communications）上的一项研究，该分子的工作原理与同家族的其他蛋白质不同。

"CRISPR系统有不同的类型，我们这次研究的重点是一种叫做CRISPR-Cas13bt3的系统，"帮助领导这项研究的德克萨斯州癌症预防与研究所学者、生物科学助理教授高扬说。"它的独特之处在于体积非常小。通常，这类分子包含大约 1200 个氨基酸，而这个分子只有大约 700 个，所以这已经是一个优势了。"

Emmanuel Osikpa（左起）和邓翔宇

体积小是一个优点，因为它可以更好地进入和传递到目标编辑位点。与Cas9蛋白相关的CRISPR系统不同--Cas9蛋白通常以DNA为靶标--Cas13相关系统以RNA为靶标，RNA是将DNA编码的遗传信息转化为组装蛋白质蓝图的中间"说明书"。

研究人员希望这些 RNA 靶向系统能用于对抗病毒，因为病毒通常使用 RNA 而不是 DNA 来编码其遗传信息。

"我的实验室是一个结构生物学实验室，"高扬说。"我们试图了解这个系统是如何工作的。因此，我们的部分目标是能够在三维空间中看到它，并创建一个模型，帮助我们解释其机制。"

用冷冻电子显微镜制作的最小 CRISPR-Cas13bt3 分子模型。要识别和切割的 RNA 用浅蓝色表示，而剪刀则由品红色和青色的结构域组成。控制 CRISPR-Cas13bt3 的两个环分别用绿色和红色表示。图片来源：高扬实验室/莱斯大学提供

研究人员使用低温电子显微镜绘制了CRISPR系统的结构图，将分子放在一层薄冰上，然后发射一束电子穿过它，生成数据，然后将数据处理成详细的三维模型。结果令他们大吃一惊。

"我们发现这个系统部署了一种不同于 Cas13 家族其他蛋白质的机制，这个家族中的其他蛋白质有两个最初分开的结构域，在系统被激活后，它们会合到一起--有点像剪刀的两臂--然后进行剪切。这个系统则完全不同：剪刀已经存在，但它需要在正确的目标位点钩住 RNA 链。为此，它在这两个独特的环上使用了一个结合元件，将蛋白质的不同部分连接在一起"。

Emmanuel Osikpa（左起）、Xue Sherry Gao、Xiangyu Deng、Jamie Smith、Seye J. Oladeji 和 Yang Gao。图片来源：Jeff Fitlow 摄影/莱斯大学

高扬实验室的博士后助理研究员邓翔宇说，"确定蛋白质和RNA复合物的结构确实很有挑战性，我们必须做大量的故障排除工作，使蛋白质和 RNA 复合物更加稳定，这样我们才能绘制出它的结构图。"

研究小组弄清了该系统的工作原理，化学和生物分子工程师高雪莉实验室的研究人员就开始对该系统进行调整，以便通过在活细胞中测试其活性和特异性来提高其精确度。

"我们发现，在细胞培养过程中，这些系统能够更容易地锁定目标，"化学与生物分子工程学泰德-N-劳（Ted N. Law）助理教授高雪莉（Sherry Gao）说。"这项工作真正难能可贵的地方在于，详细的结构生物学洞察力使我们能够合理地确定提高工具特异性所需的工程努力，同时仍能保持较高的靶标 RNA 编辑活性。"

邓翔宇 图片来源：Jeff Fitlow/莱斯大学

薛高实验室的研究助理埃马纽埃尔-奥西帕（Emmanuel Osikpa）进行了细胞实验，证实了工程化的Cas13bt3能够高保真地靶向指定的RNA基团。

Osikpa说："我能够证明，这种工程化的Cas13bt3比原始系统的性能更好。对结构的全面研究凸显了有针对性的、以结构为导向的方法比大规模、高成本的随机诱变筛选更有优势。"